小分子抑制劑選擇指南
小分子抑制劑是了解蛋白質功能及其在正常生理和疾病病理中的作用最容易獲得和最通用的工具之一。為了在詢問生物過程或驗證新目標方面有價值，這些工具必須滿足提供可靠和可重復數據的必要標準。由于有時很難從大量可用的分子中確定最合適的抑制劑，我們收集了一系列在選擇過程中應該考慮的參數。
當你在研究中考慮使用每一種新的小分子時，必須注意它的1)化學性質，2)效力，3)選擇性和4)使用環境。最好查閱科學文獻，了解您所在領域的成熟工具以及某些化合物可能存在的優點和缺點（例如，細胞毒性或脫靶效應）。此外，對于每個產品愛研提供相關的詳細生物信息，以幫助您為您的實驗選擇正確的化合物。通常對于更新穎或相對未鑒定的抑制劑，最好自己進行初步測試，以了解化合物在實驗系統中如何反應。雖然并非所有化合物在每種情況下都需要達到以下建議的閾值，但考慮這些參數將幫助您確定探針是否適合您的目的。
化學性質 | |
結構 | 具有明確的化學結構，其合成方法應該是可復制的。避免常見的毒性部分和pan試驗干擾部分(PAINS)。同樣避免化學反應基團，除非需要，例如共價加成。 |
穩定性 | 應在相關介質中保持穩定性（純度和化學特性），并注意pH敏感性。活動應保留在文化媒體。分子不應表現出非特異性的化學反應性（例如，氧化還原反應或膜不穩定）。 |
溶解度 | 在水介質中的溶解度應足夠（例如，IC50的10倍或低% DMSO中的0.05 μg/ml）。溶解度和親脂性都需要平衡。高電荷，高可溶性化合物可能顯示低細胞或組織滲透性。疏水化合物可能表現出高滲透性和效力，同時存在溶解度問題。使用鹽形式的疏水分子應提高水溶解度。 |
滲透性 | 通過被動或主動運輸的滲透性對于細胞活性是必不可少的。血腦屏障穿透對于預期的中樞神經系統(CNS)效果很重要。Caco-2細胞滲透性測定或平行人工膜滲透性測定(PAMPAs)是評估被動擴散的常用測定方法。MDCK-MDR1滲透性可用于評估中樞神經系統滲透，包括p -糖蛋白(PGP)的主動外排。 |
效價 | |
IC50 和 Ki | IC50和Ki是表示抑制劑效力的最常用方法。在酶抑制的背景下，IC50表示在給定的實驗條件下將酶反應速率降低50%所需的抑制劑的濃度。Ki表示抑制劑-目標復合物分解(koff)與抑制劑-目標復合物形成(kon)的比值，用于抑制劑與酶的結合。術語Ki是一個熱力學平衡常數，因此是一個固定值。另一方面，IC50是在一組確定的條件下的抑制作用的表示，并將根據反應環境中存在的底物濃度等因素而變化。對于競爭抑制劑，IC50可以通過Cheng-Prusoff方程與Ki相關:IC50=Ki*(1+[S]0/Km)。這是一個有用的基于網絡的工具，可以使用不同的抑制劑結合模型將IC50值轉換為Ki值。
注意，對于酶以外的蛋白質（如G蛋白偶聯受體或離子通道），拮抗劑的功效也可以通過Ki或IC50來報告。在GPCRs的情況下，IC50（或通常EC50）是細胞反應抑制的指示（即cAMP濃度的降低），而Ki僅指與天然配體結合在受體上。 |
體外試驗 | 體外藥效基準標準通常為IC50或Ki值在生化測定中為100 nM，在細胞測定中為1-10 μM。酶測定的效力應與細胞中的效力相關。使用盡可能低的濃度，以避免脫靶效應。僅在濃度為10 μM時對細胞有效的抑制劑可能是非特異性靶向蛋白質。 |
體內試驗 | 體內效力基準標準應達到目標組織中與細胞效力相關的水平。必須注意與化合物的吸收、溶解、代謝或排泄有關的影響。代謝穩定性是關鍵問題，如果該化合物將推進動物研究。 |
濃度依賴性 | 當使用低到高范圍的推薦濃度進行實驗時，劑量依賴性活性應很明顯。在飽和濃度下對目標的近乎完全抑制證實了該化合物的功效。 |
構效關系 | 構效關系(SAR)分析可以解釋一系列具有不同活性的化合物與一種酶或受體的結合，從而了解目標蛋白結合的要求、允許量和限制。SAR系列覆蓋3-4個效能數量級是很重要的。一個“平坦”的合成孔徑(SAR)，即包含巨大結構差異的整個系列化合物都具有近乎等效的弱效力，可以表明給目標下藥的難度增加。 |
可選擇性 | |
數據剖析
| 分析將定義對相關目標的選擇性，這通常是一個比效力更關鍵的因素。通常情況下，在生化分析中，靶標的效力比其他家族成員強10-100倍的因素定義了一種抑制劑對該靶標的選擇性。針對你感興趣的目標設計的選擇性抑制劑仍然可以在更高濃度下結合其他蛋白質。重要的是要了解任何與特定化學類相關的額外活動。 |
陰性對照 | 可以設計陰性對照實驗，以證明該抑制劑在用于抑制所需靶標的濃度下，不會有效地改變任何脫靶蛋白的功能。經過充分考慮的陰性對照，如僅將細胞或蛋白質暴露于溶劑或替換密切相關的非活性結構類似物，如R/S立體異構體，有助于確認抑制劑的效果。 |
陽性對照 | 陽性對照實驗可用于證明在效果不明顯的情況下，抑制劑的行為符合預期。對照組不接受實驗治療，而是接受已知能產生預期效果的其他治療。 |
正交探測器 | 具有相似活性但來自不同化學型和/或作用方式的正交探針也可考慮用作附加對照。如果正交探針產生類似的反應，則更有可能是對靶標的抑制導致了所觀察到的表型。如果沒有，那么混淆脫靶或毒性作用可能是由抑制劑引起的。 |
使用環境 | ||
作用機理 | 作用機制對于進一步定義抑制劑的性質非常重要，以便確定天然底物在生理濃度下如何調節抑制劑的功效，并確定與該機制相關的任何漏洞。潛在的抑制事件包括: | |
| 不可逆抑制-抑制劑 | 不可逆抑制-抑制劑通常通過共價附著結合酶，不可逆地使酶失活。雖然不可逆抑制劑通常是共價的，但非共價抑制劑有時可以很長時間地發揮不可逆抑制劑的作用。 |
| 可逆抑制劑 | ● 可逆抑制可以分解為以下幾種: ● 競爭抑制-抑制劑和底物競爭自由酶，但每一個都阻礙了對方的結合，因為這種結合事件通常發生在目標的活性位點(正位位點)，正是底物也結合的地方。 ● 非競爭性抑制-抑制劑與游離酶和酶-底物復合物結合得同樣好。雖然非競爭性抑制通常發生在變構位點，但非競爭性抑制也可以在結合正構位點時發生，通常在活性位點是雙底物位點的情況下(酶與一種底物競爭，但與另一種底物不競爭)。 ● 非競爭性抑制-抑制劑只能與酶-底物復合物結合，形成無活性的可逆三元復合物。非競爭性抑制是混合抑制的一種特殊情況。 ● 混合抑制-抑制劑與酶的結合在自由酶和酶-底物復合物中不同。這種類型的抑制劑可能表現出對一種狀態(非競爭性抑制)或另一種狀態(競爭性抑制)的更大親和力。 ● 變構抑制-抑制劑結合到靶上的變構位點而不是活性位點，引起靶酶的構象變化，這是抑制所必需的。這些構象變化會影響通常酶-底物活性位點復合物的形成，破壞過渡態的穩定，或降低降低催化活化能的能力。 ● 部分抑制-酶-底物-抑制劑相互作用產生的復合物比酶-底物復合物的周轉率低。部分活性仍然存在，因為酶-底物-抑制劑復合物的催化中心可能保留一些在底物附近排列和促進催化的能力。 ● 緊密結合抑制-最初的酶抑制劑復合物經歷異構化形成第二個更緊密的復合物。緊密結合抑制劑傾向于顯示非競爭性表型，即使它們可以以競爭性、非競爭性或非競爭性的方式與目標酶結合。因為這可以表現為緩慢增加的酶抑制，這是時間依賴的，傳統的Michaelis-Menten動力學將給出一個錯誤的Ki值。通過分析kon和koff速率常數，可以得到更真實的Ki值。 ● 時間依賴性抑制-抑制劑在酶周轉的時間尺度上緩慢地與酶結合，這具有減緩觀察到的抑制發作的效果。這可能導致催化劑速率常數(kcat)值變慢。 |
抑制物-靶點動力學 | 抑制物-靶點動力學，包括kon、停留時間和koff，為化合物的效力和選擇性增加了額外的維度。與靶標緩慢解離的化合物在較低濃度時可能具有較長的活性，從而使劑量水平或劑量頻率降低。通常停留時間比熱力學效力更能與體內活性相關。 | |
靶標易損性 | 目標脆弱性是觀察到效果所需的目標參與的最低水平的函數。高易損性靶標需要較低水平的靶標占用(即較低水平的抑制劑暴露)才能達到預期效果。以細胞為基礎的沖洗實驗可以通過幫助確定一旦抑制劑從系統中移除，目標接觸的表型后果，從而提供對目標脆弱性的深入了解。 | |
生理環境 | 必須考慮目標的生理環境和目標交戰的下游后果。例如，與該途徑中的其他酶相比，破壞一種催化代謝途徑中限速步驟的酶可能會產生更大的后果。在抗菌或抗癌的背景下，抑制生化途徑的最后步驟，高能量/高成本生化產品的下游，可能被證明對目標細胞特別有毒。 | |
時間范圍 | 在設計試驗時，應考慮預期表型效應或觸發信號事件級聯所需的時間范圍，以相應地捕獲這一時間長度。 | |
補充實驗 | 使用可用的RNAi或突變體的互補實驗，在可用時，有助于就生物系統中給定目標的作用建立共識。 | |
適應性 | 化合物對目標的應用適應性最終取決于它與所研究假設的生物學背景的聯系程度，因為在一個生物系統中使用抑制劑不一定能推斷出另一個生物系統。一種適合目的的抑制劑既適用于靶標，也適用于更廣泛的科學背景。 | |
可得性 | 該化合物的可用性是廣泛的，并且可以獲得后續使用的數量。 | |
